DNA亲子鉴定-三种DNA提取要领

发布日期:2021-07-06浏览量:98

(一)QIAGEN法

采用QIAGEN公司的QIAamp@ DNA mini and blood mini提取试剂盒,颠末卵白酶K消化、硅膜过滤、洗涤杂质与DNA洗脱多少步调后可以获得纯度较高的DNA。详细操纵步曩蟹下瞬述:

1)在脱蜡后的待检样本中插手180µl Buffer ATL,另加20µl卵白酶K,摇匀置56℃中孵育消化直至组织彻底消化,液体呈清亮为止。2)加200µl AL缓冲液置70℃裂解10min。3)加200µl乙醇(96%~100%)振荡混匀。4)在离心计心情上稍作离心后,将全部液体小心转移到硅膜层析柱上,以6000g (8000r/ min)离心2min,弃搜集液。5)将硅膜层析柱移至另外一洁净搜集管上,小心插手500µl AW1缓冲液,以6000g (8000r/min)离心2min,弃搜集液。6)将硅膜层析柱移至另外一洁净搜集管上,小心插手500µl AW2缓冲液,以6000g (8000r/min)离心2min,弃搜集液。7)再以20 000g (14 000rlmin)离心3min以使硅膜彻底干透。8)将硅膜层析柱移至逐个般离心管(1. 5ml)上,加20~100µl TE缓冲液将连系在硅膜上的DNA洗脱。甲醛固定组织的洗脱液体积为200yl,2片白腊包埋组织的洗脱液体积为100µl,H.E染色切片组织的洗脱液体积为50µl。9)在室温(15~25℃)前提下静置约1min,以20 000g (14 000r/min)离心1min,搜集DNA洗脱液。(二)IQ法采用Promega公司的Tissue and Hair Extraction Kit (for use with DNA IQTM)提取试剂盒,颠末卵白酶K消化、磁化树脂连系(磁化架)、洗涤纯化(lysis buffer,3次)和DNA洗脱(Elution buffer 100µl,65℃)四个步调可完成DNA提取,操纵过程以下所述。1)在脱蜡后的待检样本中插手200µl含有卵白酶K(1.8mg/ml)和DTT (0. Imol/L)的孵育缓冲液(IB),摇匀,置于56℃中孵育消化,直至组织彻底消化,液体呈清亮为止。2)加400µl消化缓冲液(lysis buffer)。3)加14µl树脂(Resin),振荡混匀,置于室温5min后再振荡2s当即放置在磁化架上连系,移除过剩液体。4)再加100µl含有DTT (0.01mol/L)的消化缓冲液(lysis buffer),振荡2s当即放置在磁化架上连系进行洗涤纯化。反复3次。5)在磁化架大将树脂(Resin)嘹干5min,加20~100ul洗脱缓冲液(EB)振荡后置65℃5min,而后振荡2s后当即放置在磁化架上,搜集液体DVA。(三)Chelex-100法1) 56℃消化(200µl 5%Chelex,40µl 10mg/µl卵白酶K,8µl 1mol/L DTT) 至溶液明澈。2)激烈震荡5 5~10s。3)滚水煮8min。4)激烈振荡5~10s; 14000r/min离心5min;取上清液用于扩增反馈。

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